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Resistencia en plantas: la otra cara de la moneda

Por Vanesa Segovia

Desde muy temprano la biología de las plantas llamo mi atención, recuerdo que quedé fascinada la primera vez que observé una planta creciendo en un tubo de ensayo, “¿como puede ser esto?”, me pregunté, y esta pregunta forjo mi interés en el trabajo de laboratorio. Durante mi paso por la universidad me interesé en mejorar la producción en plantas y me di cuenta que las enfermedades son uno de los factores limitantes, y que las estrategias de control existentes se quedaban cortas comparadas con la dinámica de un fitopatógeno (patógenos que afectan a las plantas), que siempre lograba recuperar su capacidad de infección pese a los esfuerzos por controlarlo. Con el tiempo desarrollé un interés especial en la aplicación de biología molecular y la transformación genética para solucionar problemas relacionados con las enfermedades de las plantas. La idea de proporcionar nuevas alternativas para controlar enfermedades me fascinaba, y convencida de que generando plantas transgénicas se haría un aporte significativo, empecé mi trabajo en el laboratorio en esta área. Tiempo después, la experiencia en investigación me proporcionó una nueva visión acerca del manejo de cultivos y encontré muy interesante estudiar el problema de fitopatología por el lado del patógeno, es así como terminé involucrada en un área novedosa conocida como biología de efectores, de la cual les relatare a continuación.

Un poco de historia

Las enfermedades en las plantas son uno de los problemas más serios que enfrentamos en la era moderna, dado que gran parte de nuestros alimentos y recursos energéticos provienen de las plantas. Probablemente la generación de plantas resistentes a enfermedades se realiza desde que éstas fueron domesticadas, pero el fitomejoramiento con base científica tomó forma después de la publicación de las leyes de la herencia de Mendel y de que Sir Rowland Biffen cruzara por primera vez plantas de trigo para obtener una progenie resistente a la roya amarilla (Puccinia striiformis) en 1905 [1]. Desde entonces gran parte de los esfuerzos de los fitomejoradores se enfocan en la selección y desarrollo de variedades resistentes. Sin embargo esta resistencia ejerce una presión de selección sobre los patógenos que controla y los obliga a cambiar rápidamente para recuperar su virulencia, lo cual hace que la variedad quede inocua al cabo de unos pocos años (alrededor de 3 a 5 años). En 1955 Harold Henry Flor planteó el modelo del gen-por-gen que explica el origen de esta variación[2]. Flor observó que la habilidad de un patógeno para causar enfermedad (otorgada por un gen denominado Avr) se hereda al igual que la resistencia en plantas (conferida por genes R), por lo tanto la resistencia sólo tiene lugar cuando se conforma la dupla R-Avr, donde R:

* Actúa como un receptor que percibe a un Avr.

*Reconoce que la planta está siendo atacada.

*Desencadena los procesos de defensa.

En dado caso que falte alguno de los componentes de la dupla, los mecanismos de defensa no se activan y la planta es susceptible. Más aun, si el patógeno varía (muta) su gen Avr, el reconocimiento no tiene lugar y la infección progresa exitosamente [3].

Dado que los parásitos establecen una estrecha relación con el organismo que colonizan, se presume que los patógenos neutralizan las respuestas de defensa del hospedero secretando un grupo de proteínas que solo se expresan cuando entran en contacto con el organismo hospedador, a estas proteínas se les conoce como efectores [4]. Por ejemplo en hongos fitopatógenos (causan enfermedades en las plantas), las proteínas responsables de la infección sólo se expresan cuando ocurre interacción entre la planta y el patógeno. Aunque dichas proteínas son fundamentales pues garantizan el éxito en la infección, también pueden jugar en contra del patógeno, dado que si son reconocidas por las plantas constituyen un Avr que desata procesos de defensa (como consecuencia de la dupla R-Avr) y la infección no puede progresar [5].

Entonces para entender la dinámica de un fitopatógeno y diseñar estrategias de control más durables, se hace necesario conocer en detalle no solo al componente de resistencia en las plantas (R), si no que también se requiere estudiar y caracterizar al componente del patógeno (los efectores).

“La caja de Pandora”

Pese a su importancia ningún gen Avr ha sido descrito en las royas que atacan los cereales. En el caso del trigo, dos de las enfermedades más agresivas son la roya de la hoja y la roya amarilla causadas por los hongos Puccinia triticina y P. striiformis, respectivamente. Estos hongos biotróficos (parásitos obligados) se caracterizan por que forman haustorios, una hifa (cuerpo vegetativo de un hongo) modificada con doble función: la obtención de nutrientes y la secreción de proteínas que garanticen el éxito en la infección. El haustorio se forma únicamente cuando el hongo esta en contacto con la planta, por lo que tiene una función exclusiva durante la infección, de manera que los genes expresados en esta estructura son determinantes para la sobrevivencia del patógeno dentro de la planta [6]. Por lo tanto, el haustorio constituye una especie de “caja de Pandora” que guarda los secretos que hacen posible la infección en trigo, y para conocer estos secretos debemos indagar específicamente en esta estructura.

Para lograr un mejor entendimiento de la roya de la hoja, durante mi tesis de doctorado aislé haustorio de hojas de trigo infectadas y extraje ARN de ellas para fabricar una colección de genes (llamada comúnmente genoteca) que se expresan específicamente durante la infección [7]. Después de realizar análisis bioinformáticos, identifiqué secuencias completas que codificaban para genes en la roya de la hoja, y me dedique a caracterizarlos in silico (usando herramientas computacionales). Dado que aun no se ha descrito un Avr en la roya de cereales, no se sabe a ciencia cierta que características pueden tener este tipo de genes. Sin embargo, los Avr descritos en otros hongos comparten algunas características muy generales relacionadas con su función dentro de las plantas (como por ejemplo la presencia de péptidos (secuencia de aminoácidos) señal que permite su translocación desde el hongo hacia la planta). Entonces, considerando la información disponible en otros patosistemas, generé un criterio de selección que me permitió aproximarme a posible genes candidatos. Una vez identificados los genes candidatos, mi siguiente paso fue validar su función y establecer si al ser expresados en la planta (en ausencia del patógeno) desencadenan procesos de defensa, que puedieran ser visualizados y cuantificados con pruebas de laboratorio. Para este fin, utilicé técnicas de cultivo de tejidos y realicé experimentos expresando transitoriamente los genes candidatos en células vegetales, corroborando la función biológica de las secuencias que fueron predichas inicialmente por bioinformatica. Para complementar estos análisis, estudie la expresión de los genes candidatos a diferentes tiempos de infección, con lo cual agrupé evidencia para demostrar que dos genes candidatos de la roya de la hoja se expresan únicamente en contacto con la planta (específicamente en haustorio) y que al ser expresados en la hoja generaron respuestas de defensa [7]. Dado que ésta es un área poco explorada en el patosistema de roya-trigo, y por lo tanto no hay mucha información, estos genes constituyen un punto de partida para el estudio de efectores en la roya de la hoja del trigo.

Los genes de R son conservados los Avr no lo son

Muchos de los genes R que han sido clonados en plantas se agrupan en familias de genes que codifican proteínas con fragmentos conservados (dominios) involucrados en el reconocimiento de proteínas del patógeno (como los Avr; [4]). Sin embargo las proteínas Avr no son conservadas entre los diferentes microorganismos y en algunos casos son únicas, por lo que no se pueden hacer asociaciones entre diferentes patógenos para diseñar estrategias de control. Ahora bien, aunque dentro la misma especie (grupo de organismos capaces de entrecruzarse y de producir descendencia fértil), los Avr son conservados, ellos están sujetos a pequeñas variaciones ocasionadas por la presión de selección ejercida por los genes R y los factores ambientales [8]. Los estudios de evolución en los genes Avr se enfocan en la variación de estos dentro de la misma especie, considerando presencia, ausencia, mutaciones de punto o rearreglos en los genes o cualquier variación que permita evadir el reconocimiento de los receptores en las plantas ([8],[9]). Para algunas royas la diversidad en genes Avr se correlaciona con la capacidad de los aislamientos en vencer la resistencia en variedades comerciales [10], entonces el estudio de la variación de los genes involucrados en la infección en diferentes aislamientos podría llevarnos a identificar Avr en la royas que atacan los cereales.

Durante mi investigación posdoctoral, he puesto mi atención en la roya amarilla del trigo (P. striiformis), que es una roya caracterizada por su agresividad debido a su alta capacidad de variación y adaptabilidad a diferentes condiciones climáticas [11]. Con el ánimo de establecer plataformas de comparación que permitan identificar genes que pueden volver un aislamiento avirulento (incapaz de infectar) en uno virulento (capaz de infectar), hemos secuenciado aislamientos con diferentes distribuciones geográficas y con diferente espectro de virulencia, utilizando métodos de secuenciación denominados NGS (por su sigla en inglés New Generation Sequence), para generar una aproximación al genoma de estos aislamientos. Adicionalmente, extraje haustorio de la roya amarilla, y el ARN se secuenció utilizando una estrategia conocida como RNAseq, que permite obtener datos de expresión de genes durante la infección [11]. El siguiente paso en esta investigación requiere caracterizar la función en planta de varios genes candidatos al mismo tiempo, lo cual se logra con ensayos de expresión transitoria que involucran células de la planta despojadas de la pared celular (conocidas como protoplastos) [12], y de esta forma acelerar la identificación de genes de la roya involucrados en la infección. Todo esta investigación constituyen un esfuerzo para encontrar y caracterizar genes Avr en P. striiformis y facilitar con este conocimiento el diseño nuevas estrategias de control, que se presume serían más durables pues tienen en cuenta el aspecto del hongo que hasta el momento ha sido ignorado por los fitomejoradores.

Después de explorar en diversas áreas de investigación, hoy estoy mas convencida del aporte de la biología molecular en la obtención de cultivos resistentes que garanticen una buena producción. Nunca imaginé que el objeto de mi curiosidad me llevaría a explorar diversas formas de abordar un problema y de hacer investigación… después de todo, todavía me sorprende contemplar plantas de trigo creciendo en un tubo de ensayo.

Referencias

[1]Biffen, R.H. 1905 Experiments with wheat and barley hybrids, illustrating Mendel’s Laws of heredity. J. Roy. Agric. Soc. 65:337-45

[2]Flor, H. H. 1942 Inheritance of pathogenicity in Melampsora lini. Phytopathology 32, 653–669.

[3] Flor, H. H. 1955 Host-parasite interaction in flax rust: its genetics and other implications. Phytopathology 45: 680–685.

[4]Dangl J L and Jones JD. 2001. Plant pathogens and integrated defence responses to infection. Nature 411: 826–833.

[5]Dodds PN and Rathjen J P. 2010. Plant immunity: towards an integrated view of plant–pathogen interactions.Nature reviews. 11: 539-548.

[6]Staples RC. 2001. Nutrients for a rust fungus: the role of haustoria. Trends in Plant Science. 2001 6 (11): 496–498http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1360138501021264#

[7]Segovia V. 2010. Identification of wheat leaf rust (Puccinia triticina) genes expressed during the early stages of infection. at: http://krex.kstate.edu/dspace/bitstream/handle/2097/6759/VanesaSegovia2010.pdf;jsessionid=D51C19A973312C975C8221D011944477?sequence

[8]Van der Merwe M M, Kinnear M W, Barrett LG, Dodds P N, Ericson L, Thrall P H and Burdon J J. 2009. Positive selection in AvrP4 avirulence gene homologues across the genus Melampsora Proc. R. Soc.B.doi:10.1098/rspb.2009.0328 http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/early/2009/05/14/rspb.2009.0328.full.html#related-urls

[9]Farman M L, EtoY, Tosa Y, Nakayashiki H, Mayama S & Leong SA. 2002. Analysis of the structure of the AVR1-CO39 avirulence rice-infecting isolates of Magnaporthe grisea. Mol. Plant Microbe Interact. 15, 6–16.

[10]Dodds P N, Lawrence GJ, Catanzariti AM, The T, Wang CI A, Ayliffe MA, Kobe B and Ellis J G. 2006. Direct protein interaction underlies gene-for-gene specificity and coevolution of the flax resistance genes and flax rust avirulence genes. Proc. Natl Acad.Sci. USA 103: 8888–8893

[11]Cantu D, Saunders D, Segovia V, Bayles R, Chen X, Kamoun S, Dubcovsky J and Uauy C. 2012. Discovery of Puccinia striiformis f.sp. tritici effectors by whole genome resequencing and comparative genomics. In preparation

[12]Segovia V, Uauy C. 2012. In vivo expression system for effector validation in hexaploid wheat (Triticum aestivum L.) using protoplast electroporation. XV International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions. July 29th - August 2nd, 2012, Kyoto, Japan. POSTER.