Por Adriana Almeida
Si nos detenemos un momento a pensar en como vivimos nuestro día a día y la manera en la que los electrodomésticos y equipos digitales hacen parte de nuestra cotidianidad, es difícil imaginar como sería nuestra vida sin ellos. Sin embargo, no fue hace mucho tiempo que el desarrollo de los sistemas electrónicos ocurrió. Fue a partir de la creación del transistor eléctrico en 1947, por los físicos norteamericanos John Bardeen, Walter Brattain y William Shockley [1]. La posibilidad de alterar una señal universal (electricidad) entre dos estados discretos (encendido o apagado) en fracciones de segundo ha sido la base de la construcción de redes de circuitos eléctricos extremadamente complejos. De manera similar a los transistores, los genes dentro de nuestro ADN pueden ser completamente encendidos (expresados) o completamente apagados (no expresados). Este control dinámico de los genes nos permite hacer una analogía entre la regulación génica y los circuitos eléctricos. Por lo tanto podemos inferir que el control de señales genómicas dentro de las operaciones celulares funcionan como redes de circuitos. El proceso de expresión génica es regulado a nivel del ADN, ARN, y proteínas y puede ser manipulado en cada una de estas etapas por medio de ‘interruptores’ moleculares [2].
En los últimos 50 años, un desarrollo acelerado en los campos de la genética, la biología celular, molecular y de sistemas, así como avances en la biotecnología y la bioinformática han producido una vasta cantidad de literatura científica en estos temas.
Nuevos campos de investigación se han desarrollado, los cuales explican la manera en la cual los genes pertenecientes a un genoma están organizados y estructurados (genómica); como ocurren los procesos de lectura génica (proceso conocido como transcripción) para la generación de un ARN mensajero (transcriptómica); de qué manera los ARN mensajeros producidos son traducidos a proteínas (proceso conocido como traducción) que ejercen y regulan un determinado proceso celular; y finalmente, cómo se organizan las proteínas en redes metabólicas que regulan y mantienen el funcionamiento de los organismos (metabolómica). Toda esta información ha llamado la atención de ingenieros químicos, electrónicos y de sistemas, que trabajando conjuntamente con biólogos, químicos y matemáticos, han generado una nueva rama de investigación multidisciplinaria conocida como la biología sintética.
Los pilares de la biología sintética
Pero indaguemos un poco cómo sucedieron los primeros adelantos en estas áreas de investigación que conllevaron al desarrollo de la biología sintética. Uno de los pilares fue el modelo sobre la regulación celular postulado por Jacob y Monod en 1961. Estos investigadores descubrieron el operon Lac en Escherichia coli. El operon Lac esta conformado por tres genes (lacZ, lacY y lacA) regulados por un promotor (un promotor es una región del ADN que es reconocida por enzimas para iniciar el proceso de transcripción). El operon Lac esta presente en bacterias y es requerido para el transporte y la degradación de la lactosa. Este descubrimiento permitió entender que las bacterias regulan genes (semejante a circuitos eléctricos) en respuesta al ambiente [3]. Igualmente, el desarrollo de técnicas moleculares como el descubrimiento de las enzimas de restricción [4] y la clonación en los 70’s, así como el desarrollo del proceso de reacción en cadena de la Polimerasa (acrónimo en ingles: PCR) en los 80’s [5] permitieron la manipulación genética de microorganismos por medio de la clonación y la expresión de genes que no hacen parte de su ADN original (ADN recombinante), para el estudio de diferentes procesos celulares, así como para la producción de proteínas y enzimas de interés.
La aparición de la biología de sistemas
En la mitad de los 90’s, la secuenciación automatizada de ADN y el mejoramiento en las herramientas computacionales permitieron la secuenciación de genomas microbianos completos, así como el desarrollo de técnicas para cuantificar ARN, proteínas, lípidos y metabolitos en forma masiva. Todos estos avances generaron una extensa cantidad de información sobre componentes celulares y sus interacciones [6], y fueron determinantes para la aparición de la biología de sistemas, en la cual biólogos e ingenieros de sistemas comenzaron a combinar experimentos in vitro (en el laboratorio) e in silico (por modelación computacional) para entender el funcionamiento celular. De la misma manera, el entendimiento global de los procesos celulares (como por ejemplo cómo son regulados los genes, cómo se producen las proteínas, cuales son sus funciones y su papel en el metabolismo) permitió la generación e integración de componentes genómicos en el laboratorio, los cuales pueden interactuar o regularse mutuamente frente a estímulos externos (proceso conocido como redes celulares sintéticas) [7]. A partir de esta etapa en la que se obtuvo una gran cantidad de información, se pudo establecer que los componentes celulares están organizados jerárquicamente, con unos elementos que controlan el funcionamiento de otros; además que hay grupos específicos de componentes que funcionan como un conjunto (similar a piezas de un engranaje) que permiten el funcionamiento de otros conjuntos de componentes (definido como componentes modulares funcionales). Como podemos apreciar, estos tipos de organización se asemejan mucho a sistemas de ingeniería [8]. De esta manera se gestó la idea que los sistemas biológicos podrían ser manipulados en el laboratorio, por medio de la reconexión o la reorganización de sus constituyentes modulares [9]. Fue entonces, hacia finales de los 90’s, cuando ingenieros químicos, electrónicos, de sistemas y mecánicos, así como físicos y químicos comenzaron a integrar la biología molecular en sus áreas de investigación [10] (Figura 1), y surgió la biología sintética, la cual puede ser usada para el estudio de la organización funcional de sistemas naturales existentes, así como para la creación de redes regulatorias artificiales que tienen un vasto potencial en áreas como la biotecnología y la salud.
Figura 1. Los principios de la biología sintética. Moléculas identificadas por medio de herramientas de la biología molecular son categorizadas dentro de una ‘caja de herramientas’ que consiste en moléculas funcionales de diferentes tipos: ARN, ADN y proteínas. Estas herramientas son utilizadas para optimizar e incrementar sus posibles funciones, aumentando de esta manera el numero de herramientas disponibles. Estas partes son utilizadas como las piezas de un engranaje, para la construcción de circuitos sintéticos (definidos como la interconexión de componentes moleculares en el laboratorio, combinando promotores, genes y represores de diferentes maneras para producir diferentes respuestas), los cuales son capaces de ejecutar procesos binarios lógicos (como por ejemplo apagar/encender; fluorescencia/no fluorescencia). Tales circuitos son incorporados en células, las cuales pueden producir valiosas moléculas, pueden reprogramar células y pueden ser usadas en terapia celular, entre otros [10].
Los primeros circuitos biológicos sintéticos
En el año 2000, los avances iniciales en la biología sintética produjeron los primeros circuitos biológicos sintéticos análogos a circuitos eléctricos en E. coli [11]. Uno de los primeros estudios desarrolló un circuito de componentes moleculares que se asemeja a un circuito de interruptor “de palanca”, en el cual se pueden inducir respuestas binarias de encendido/apagado, expresión/no expresión, fluorescencia/no fluorescencia. Este circuito se basó en el ensamblaje de tres genes: lactosa 1, el gen represor del bacteriófago P1 y el gen de fluorescencia verde. El gen de lactosa 1 (lac1) es un gen que codifica una proteína capaz de transportar y degradar lactosa en ausencia de glucosa. Este gen y su promotor fueron aislados de la bacteria E. coli y su expresión es regulada por estímulos externos como metabolitos de la lactosa y el compuesto isopropilo β-D-1-tiogalactopiranosido (del inglés Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG); el gen represor del bacteriófago P1, llamado cl, es responsable de mantener el material genético del bacteriófago (virus capaz de infectar y replicarse en bacterias) en forma de un plásmido (es decir de un ADN circular). Este gen fue aislado de un bacteriófago mutante que es termo-sensible, lo que quiere decir que puede ser regulado por estímulos externos como el calor [12]; y finalmente, el gen que codifica la proteína de fluorescencia verde (del inglés green fluorescent protein (GFP)) aislado de la medusa Aequorea victoria, que como su nombre lo indica, produce una señal de fluorescencia. Dos de los genes incluidos en el circuito, cl y lac1 son represores mutuos, lo que quiere decir que cuando la proteína cl se produce, contiene una secuencia de amino ácidos que reconoce el ADN del promotor de lac1, bloqueando la transcripción de lac1. De la misma manera, cuando la proteína lac1 es producida, esta contiene una secuencia que reconoce el promotor del gen cl, bloqueando su transcripción. El gen GFP, el cual produce una señal de fluorescencia, se encuentra corriente abajo del gen cl, lo que significa que cada vez que el promotor corriente arriba del gen cl esta libre (no bloqueado), se produce una señal de fluorescencia. Además estímulos externos regulan el ARN producido por los genes lac1 y cl. En este caso en particular, cuando las bacterias son expuestas a calor, el ARN del gen cl es degradado y su proteína no es traducida, lo que genera el desbloqueo del promotor del gen lac1. Lac1 bloquea el promotor de cl, lo cual inhibe la producción de cl y GFP, eliminando la señal de fluorescencia. Esta inhibición es eliminada al exponer las bacterias a IPTG [13]. Las bacterias con este tipo de circuito de interruptor “de palanca” pueden cambiar entre los dos estados de respuesta (fluorescencia o no fluorescencia) dependiendo de los estímulos externos (IPTG o calor) (Figura 2a) [14].
Otro prototipo de circuito sintetico desarrollado a comienzos del 2000 fue un circuito oscilante llamado ‘represilador’, que consiste en un circuito cerrado con triple retroalimentación negativa. En este caso, cuatro genes hacen parte del circuito con sus respectivos promotores: proteína represora tet (tetR), lac1, GFP y cl. La proteína tetR regula la expresion de la tetraciclina (tc), la cual hace parte de una familia de genes que codifican antibióticos. El gen tetR fue aislado de E. coli y es usado frecuentemente en biología sintética, debido a su capacidad de regulación. En este sistema en particular, cuando el gen tetR es transcrito y traducido, su proteína bloquea los promotores corriente arriba de los genes lac1 y GFP respectivamente, reduciendo asi la señal de fluorescencia. La proteína lac1 regula a su vez la expresión del gen cl. Cuando el promotor de lac1 es bloqueado, se suspende la expresión del gen, y como normalmente el ARN se degrada rápidamente, el promotor del gen cl se libera, permitiendo su expresión. La proteína cl regula a su vez el promotor de tetR, permitiendo la transcripción y traduccion de lac1 y GFP. Es por eso que cuando el circuito de “represilador” es activado, se observa una oscilación periódica con diferentes intensidades de fluorescencia [15] (Figura 2b).
Como podemos apreciar en los dos ejemplos anteriores, en este tipo de prototipos se pudieron establecer flujos de procesos de ingeniería en combinación con diseño experimental biológico durante la construcción de circuitos, los cuales incorporaron un diseño cuantitativo (cantidad de la señal de fluorescencia), una construcción física (la construcción del circuito cerrado en ambos ejemplos, que es similar a un circuito eléctrico), y mediciones experimentales seguidas por un proceso de depuración conducido a partir de la hipótesis (método científico) [16]. Igualmente durante esta primera etapa de la ingeniería sintética, se construyeron los primeros circuitos de comunicación entre células y se hicieron los primeros esfuerzos por modificar dominios de proteínas en el laboratorio (dominios proteicos son regiones dentro de la estructura de la proteína), los cuales funcionan como reguladores del ARN mensajero [13].
Figura 2. Representación esquemática de los primeros circuitos desarrollados por medio de la biología sintética durante los años 2000 al 2003 [13]. Diseño y comportamiento de los circuitos de interruptor de “palanca” (a) [14] y del “represilador” (b) [15]. Los cuadrados de colores son los promotores, las flechas de colores son los genes ensamblados en cada circuito. Las flechas negras muestran la dirección de transcripción y el comienzo de la secuencia de cada gen que se transcribe para producir un ARN mensajero. Las líneas negras terminadas sin flecha muestran los procesos de retroalimentación negativa (inhibición).
Consolidación de la biología sintética
En el año 2004 se llevó a cabo la primera conferencia internacional de biología sintética en el Instituto Tecnológico de Massachusetts (acrónimo en inglés: MIT) y la primera competencia internacional de ingeniería en máquinas genéticas (acrónimo en inglés: iGEM) en la cual, se trazó el objetivo a largo plazo de generar un genoma completo ensamblado por ingeniería [17]. Esto quiere decir, colocar todos los componentes de un genoma funcional en el laboratorio. Por primera vez, grupos de investigación en esta área comenzaron a tratar de mejorar los sistemas genéticos por medio de la ingeniería para la creación de colecciones de partes modulares y el desarrollo de métodos para la construcción y la sincronización de circuitos biológicos artificiales [18]. Quizás uno de los éxitos mas notorios de este periodo fue en el área de la síntesis de isoprenoides para la producción de precursores de artemisina, un medicamento anti-malaria, producido naturalmente por Artemisia annua [19], el cual generó una gran apreciación por el potencial de la biología sintética en la salud humana.
A partir del 2008 hasta el 2013 se produjo un mayor grado de complejidad en el desarrollo de circuitos biológicos de ADN mediante el uso de arreglos mas amplios de partes modulares mejor caracterizadas, incrementando la precisión e inducción de comportamientos de diferentes tipos. Este avance fue favorecido por el mejoramiento en métodos de ensamblaje de ADN y la reducción substancial de los costos en la síntesis de ADN, permitiendo así sintetizar genes a menor costo. En este periodo se desarrollaron igualmente los primeros circuitos sintéticos de ARN para el control de la regulación de la expresión génica como es el caso de la re-organización global del control de la trascripción del sistema inmune CRISPR-Cas en bacteria [20] y [21]. Además, otros estudios de este periodo se han enfocado en la regulación proteómica, sin embargo esta rama de investigación se encuentra en su fase inicial y la construcción de plataformas mas robustas es necesaria para permitir el control post-traduccional de proteínas de interés.
Igualmente, el desarrollo de estudios de ingeniería metabólica ha avanzado rápidamente. Se han creado circuitos sintéticos incorporando enzimas heterólogas (no producidas en el organismo) que pueden llenar los vacíos presentes en el sistema metabólico del hospedero. Este es el caso de varios estudios en la producción de biocombustibles [22] y bioplásticos mediante la manipulación de rutas metabólicas en E. coli. En el 2013 se logró la producción a gran escala del medicamento anti-malárico artemisina por medio del desarrollo sintético de la ruta metabólica del ácido artemísinico en levadura [23]. Otras tecnologías de terapia fueron desarrolladas durante este año, incluyendo una terapia basada en el uso de fagos y el desarrollo de estrategias terapéuticas celulares especificas. Este tipo de avances han generado mucha polémica debido a los riesgos en la salud y la seguridad de la biología sintética. Por lo cual se ha conformado una comisión de bioética que ha impulsado el desarrollo de controles de organismos sintéticos por medio del uso del interruptor programable para muerte microbiana, el cual puede prevenir la liberación de los organismos modificados al ambiente [13].
En el 2010 se publicaron los resultado de los dos primeros genomas sintetizados químicamente en la bacteria Mycoplasma mycoides [24]. Los genomas de interés fueron recreados mediante el ensamblaje de cassettes sintéticos de ADN por medio de recombinación in vivo en levaduras, y luego fueron transferidos a células de las bacterias recipientes. Un método similar fue utilizado en la producción de la primera levadura (Saccharomyces cerevisiae) con partes de un cromosoma ensamblado en el laboratorio, en el que se incorporaron genes sintetizados químicamente, sitios de recombinación alrededor de cada gen y se removieron regiones inestables del fragmento cromosómico original como son los transposones [25].
Conclusión
Como podemos apreciar, la biología sintética ha permitido la transferencia de todo el conocimiento científico adquirido en la era de las ‘ómicas’ (genómica, transcriptómica, proteómica, metabolómica) a una esfera mucho mas aplicada que puede abrir nuevos horizontes en campos como la salud humana, por medio de la terapia molecular personalizada para el tratamiento de enfermedades como cáncer, desordenes metabólicos, diabetes, malaria, e infertilidad [26]; en la agricultura, para la detección y el control de patógenos en plantas [27]; y en la producción de energía, por medio de la producción de biocombustibles [28] o plantas que iluminan en la oscuridad [29]. Todas estas posibles aplicaciones podrían ser muy valiosas para nuestra sociedad. Sin embargo, la falta de una comunicación apropiada por parte de las compañías o entidades que están desarrollando estas tecnologías con el publico puede generar miedo o desconfianza, pues no se ha creado una comunicación clara y rutinaria con el publico sobre los avances y las aplicaciones de la biología sintética. Además existe el riesgo de la manipulación de estas nuevas tecnologías por medio de monopolios, lo cual puede generar un acceso desbalanceado de estos avances para el beneficio de las comunidades. De igual manera, el progreso en las aplicaciones de la biología sintética, y en general de nuevas tecnologías, debería ir de la mano con el desarrollo de regulaciones a nivel gubernamental sobre las mismas, para garantizar un manejo ético y responsable.
Literatura citada
[1] https://en.wikipedia.org/wiki/Transistor
[2] Ausländer S and Fussenegger M. 2013. From gene switches to mammalian designer cells: present and future prospects. Trends in Biotechnology. 31 (3) 155-168.
[3] https://www.dnalc.org/view/15884-The-lac-operon.html
[5] Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, Erlich HA. 1988 Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487. DOI: 10.1126/science.2448875.
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[20] Wiedenheft B, Sternberg SH and Doudna JA. 2012. RNA-guided genetic silencing Systems in bacteria and archaea. Nature 482, 331- 338.
[21] http://biogenic-colombia.blogspot.ca/2015/10/crispr-una-herramienta-para-editar-el.html
[22] Steen EJ et al. 2010. Microbial production of fatty-acid-derived fuels and Chemicals from plant biomass. Nature 463, 559- 562.
[23] Paddon CJ et al. 2013. High-level semi-synthetic production of the potente antimalarial artemisinina. Nature 496, 528- 532.
[24] Gibson DG et al. 2010. Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized genome. Science 329, 52- 56.
[25] Dymond JS et al. 2011. Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic Diversity by design. Nature 477, 471- 476.
[26] Maria Karlsson and Wilfried Weber. 2012. Therapeutic synthetic gene networks. Current Opinion in Biotechnology. 23:703–711
[27] http://2012.igem.org/Team:Colombia
[28] Georgianna DR & Mayfield SP. 2012. Exploiting diversity and synthetic biology for the production of algal biofuels. Nature. Vol 488: 329- 335.
[29] http://www.glowingplant.com/
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